PCR的假陽性問題深受重視，但PCR假陰性問題相對于臨床檢測更為嚴(yán)重。就PCR假陽性的問題來說，一般僅涉及污染和引物的非特異性問題。而污染可以通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理，合理的環(huán)境設(shè)置，以及加入U(xiǎn)NG酶抗污染基本可以解決，而引物的非特異性問題基本屬于廠家試劑質(zhì)量問題。而PCR的假陰性卻不同，它涉及了與PCR實(shí)驗(yàn)的幾乎所有人員和技術(shù)環(huán)節(jié)，十分復(fù)雜。就臨床而言，大三陽檢出率低、甚至檢測PCR仍為陰性的事情也經(jīng)常發(fā)生，可見假陰性問題的嚴(yán)重性。
就PCR假陰性問題總體來說有如下因素：
一、 儀器因素
PCR實(shí)驗(yàn)對儀器的依賴性是很高的，離心機(jī)、擴(kuò)增儀都是造成PCR假陰性的因素。擴(kuò)增儀的主要問題是孔間差，引起擴(kuò)增失敗可擴(kuò)增效率降低。而離心機(jī)的影響則更容易被忽視。國內(nèi)使用離心機(jī)很少使用離心加速度（XXXg）作為參數(shù)指標(biāo)，而常使用轉(zhuǎn)數(shù)作為參數(shù)指標(biāo)，這里就存在著一個問題，由于離心機(jī)的大小不同，有效跳心半徑也不相同，因此同樣的轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的離心力相差很大（有的在數(shù)倍以上），所以在相同的離心時(shí)間下，有可能模板并沒有離心下來，造成PCR假陰性。這個問題在其他實(shí)驗(yàn)也有，但因基他實(shí)驗(yàn)都是測定大分子蛋白沉淀，對離心的速度要求較低所以不太明顯。建議使用小型臺式離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)要注意一下這個問題。
二、 試劑質(zhì)量問題
PCR實(shí)驗(yàn)的成功與否試劑的質(zhì)量至關(guān)重要，試劑的質(zhì)量問題涉及多個方面：細(xì)胞的裂解；模板的抽提；引物位點(diǎn)的選擇；Taq酶的活性等等。其中任一環(huán)節(jié)出了問題都會引起結(jié)果的假陰性。這些都是試劑質(zhì)量的問題，因此選用高質(zhì)量的PCR試劑非常重要。
三、 核酸模板問題
核酸模板質(zhì)量問題是制約PCR重要的因素之一。核酸模板在擴(kuò)增區(qū)出現(xiàn)斷裂、蛋白粘附、空間位阻等模板質(zhì)量問題都有可能引起擴(kuò)增失敗造成結(jié)果的假陰性或定量不準(zhǔn)確。由于無論什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板質(zhì)量雖然與試劑的質(zhì)量有關(guān)，但它不可能由試劑質(zhì)量完全解決。
核酸模板問題除了模板本身的問題外，還存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分（如某些蛋白、離子等）作用，而導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低甚至擴(kuò)增失敗的問題。對此，有人提倡進(jìn)行模板純化，效果較為明顯。但另一個問題又出現(xiàn)了，那就是怎樣保證純化的回收率問題?？傊?，核酸模板問題是不可避免的問題，只能努力去減少。
四、 操作人員素質(zhì)問題
PCR實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)很多，而且對每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量要求都很高，例如少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計(jì)錯誤、對于RNA抽提降解、逆轉(zhuǎn)錄失敗等等都能造成結(jié)果的假陰性。因此要求PCR的實(shí)驗(yàn)操作人員有很好的素質(zhì)，能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，并能敏銳的發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。
五、 其他
PCR實(shí)驗(yàn)中從樣品的采集、運(yùn)輸、保存開始就可以引起結(jié)果的假陰性，而對于病原體檢測（如HBV）在人體血液系統(tǒng)出現(xiàn)有周期性變化也是值得注意的因素。
PCR反應(yīng)的特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。
污染原因
一、標(biāo)本間交叉污染：
標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；病毒樣本可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
二、PCR試劑的污染：
主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：
這是PCR反應(yīng)中主要常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的檢出限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽性。
還有一種容易忽視，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
四、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照或其他陽性樣品的檢驗(yàn)室，這個問題也比較常見，其污染可能性也很大。
污染的監(jiān)測
一個好的PCR實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
對照試驗(yàn)：
一、陽性對照：
建立PCR實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本，其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)強(qiáng)陽性對照，以弱陽性對照能為可能的低濃度病毒樣本把關(guān)。另外，條件成熟的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選用第三方如衛(wèi)生部臨檢中心提供的室內(nèi)質(zhì)控品陽性參考品來監(jiān)測整個反應(yīng)體系。
二、陰性對照：
以已知陰性血清為陰性對照，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選用第三方如衛(wèi)生部臨檢中心提供的室內(nèi)質(zhì)控品陰性參考品來監(jiān)測整個反應(yīng)體系。
三、重復(fù)性試驗(yàn)。
防止污染的方法
一、 污染的預(yù)防
進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵一些操作規(guī)程，程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
1.劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
(1)試劑準(zhǔn)備區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和試劑耗材的儲存等。
(2)標(biāo)本處理區(qū)，包括標(biāo)本的接收、處理以及擴(kuò)增摸板的制備。
(3)擴(kuò)增檢測區(qū)，包括PCR擴(kuò)增檢測、結(jié)果分析和報(bào)告的發(fā)放。
(4)各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。實(shí)驗(yàn)室人員和物品的工作流向應(yīng)為試劑耗材儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本處理混樣區(qū)→樣本制備（核酸純化）區(qū)→擴(kuò)增檢測區(qū)，不得逆向流動。
(5)實(shí)驗(yàn)用品包括實(shí)驗(yàn)材料（試劑、標(biāo)本和耗材等）、實(shí)驗(yàn)器材（包括容器、板架、實(shí)驗(yàn)服、帽子、口罩、手套、鞋套等）、辦公用品（各類文件、記錄紙、筆等）以及清潔用具等，為便于鑒別，不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服。當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。
(6)清潔方法不當(dāng)也是污染發(fā)生的一個重要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增檢測區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)使用其各自的清潔用具以防止交叉污染。
2.分裝和配置試劑：核酸提取PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負(fù)壓工作臺（生物安全柜）配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中。
3. 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、提取和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液或血清樣本，應(yīng)立即更換手套。
(2)使用一次性帶濾芯吸頭，嚴(yán)禁與PCR各區(qū)的吸頭混用，吸頭使用完畢后應(yīng)立即閉蓋，不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3)避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用10%次氯酸鈉擦拭桌面。
(4)操作多份樣品時(shí)，應(yīng)事先做好標(biāo)記，然后開始操作，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。
(5加入樣本的反應(yīng)管應(yīng)配上蓋子并蓋緊。
(6)操作時(shí)設(shè)立陰陽性對照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
(7)盡可能使用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本核酸的污染，好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用。
(8)遇疑似樣本，進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)做重復(fù)或副孔實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
4.進(jìn)行血液核酸檢測的人員須具有血液核酸檢測的培訓(xùn)合格證書，并接受過實(shí)驗(yàn)室生物安全以及廠家的上崗前儀器設(shè)備操作、維護(hù)及校準(zhǔn)等的培訓(xùn)。
5.對實(shí)驗(yàn)室外來人員的控制，凡進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的人員，不論是參觀人員、進(jìn)修人員、施工工人等皆須遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)定，嚴(yán)格著裝防護(hù)服，并嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室流向制度。
6每一個核酸檢測實(shí)驗(yàn)室人員要具有區(qū)別于日常實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)防污染意識。
二、污染源追蹤
如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。
1.試劑污染：
設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上逐一處理。
2.環(huán)境污染：
在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染中常見的污染源主要有：
(1)核酸混樣及提取設(shè)備
(2)生物安全柜
(3)離心機(jī)
(4)冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺面等。此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑污染源：
(5)氣溶膠。
如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該徹底清潔實(shí)驗(yàn)室或更換實(shí)驗(yàn)場所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物（與原引物無相關(guān)性）。
三、污染處理
1.環(huán)境污染
(1)稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。
(2)紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。
2.反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列。
(2)內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等），可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法。
(4)g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。
3.尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
(1)原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT.這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產(chǎn)物中摻入大量dU.在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
(3)dU引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對長片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn)。dU引物好將dU設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。
(4)優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。
(5)需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉。
4、日常的去污染措施包括但不僅限下面幾種：
（1）用10%次氯酸鈉或75%乙醇清潔表面，包括實(shí)驗(yàn)操作臺（每日）、儲存冰箱（每周至少一次）、儀器表面（每日）等；
（2）試驗(yàn)后長時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺面和其他表面；1小時(shí)的移動紫外車60-90CM照射臺面，4小時(shí)以上的固定紫外燈屋內(nèi)照射；
（3）可高壓的加樣器的高壓消毒；對剪刀、鑷子等用品的消毒（每周一次）；
（4）實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)2小時(shí)以上（每日實(shí)驗(yàn)后），窗戶必須配置紗窗。
實(shí)驗(yàn)室發(fā)生核酸殘余污染的處理及驗(yàn)證原則
1． 終止實(shí)驗(yàn)：
一旦發(fā)生污染后，圍繞實(shí)驗(yàn)室尋找污染源耗時(shí)且很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源并清除污染為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。
2． 污染清除的驗(yàn)證：
可從核酸提取開始，按程序分步檢測15-20份純水樣本，觀察是否有陽性反應(yīng)結(jié)果的出現(xiàn)。如有，則說明實(shí)驗(yàn)室仍有污染存在，必須清潔至所有水樣本均檢測為陰性，實(shí)驗(yàn)室才可重新啟用。
總體來說，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果大的因素也就是試劑、環(huán)境、設(shè)備、人員，其中人員具有大的可變性。結(jié)合對長期以來的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)整理和質(zhì)控圖的分析，多發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，凡是好的我們肯定會繼續(xù)堅(jiān)持，不好的習(xí)慣堅(jiān)決摒棄，只有以認(rèn)真的工作態(tài)度、以謹(jǐn)慎的操作來完成每日的正常檢測實(shí)驗(yàn)，杜絕或減少假陽性的發(fā)生，才能保證血篩實(shí)驗(yàn)的正常開展。
